Phản ứng chuỗi polymerase (gọi tắt là PCR) là một kỹ thuật di truyền phân tử để tạo ra nhiều bản sao của một gen và cũng là một phần của quy trình giải trình tự gen. Trong bài viết lần này, chúng ta sẽ tìm hiểu những điều cơ bản về phản ứng này nhé!
Đôi nét
PCR là viết tắt của polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase), một kỹ thuật sinh học phân tử để khuếch đại các đoạn DNA, bằng cách tạo ra nhiều bản sao bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase trong các điều kiện được kiểm soát. Chỉ cần một bản sao của đoạn DNA hoặc gen có thể được nhân bản thành hàng triệu bản sao, cho phép phát hiện bằng cách sử dụng thuốc nhuộm và các kỹ thuật hiển thị khác.
Được phát triển vào năm 1983, quy trình PCR đã cho phép thực hiện giải trình tự DNA và xác định trình tự của các nucleotide trong từng gen. Phương pháp này sử dụng chu trình nhiệt hoặc quá trình gia nhiệt và làm mát lặp đi lặp lại của phản ứng để làm nóng chảy và sao chép DNA. Khi PCR tiếp tục, DNA “mới” được sử dụng làm khuôn mẫu để sao chép và xảy ra phản ứng dây chuyền, khuếch đại khuôn mẫu DNA theo cấp số nhân.
Kỹ thuật PCR được áp dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học bao gồm kỹ thuật protein, nhân bản vô tính, pháp y (dấu vân tay DNA), xét nghiệm quan hệ cha con, chẩn đoán bệnh di truyền và/hoặc bệnh truyền nhiễm và để phân tích các mẫu môi trường.
Đặc biệt, trong pháp y, PCR đặc biệt hữu ích vì nó khuếch đại ngay cả lượng bằng chứng DNA nhỏ nhất. PCR cũng có thể được sử dụng để phân tích DNA hàng nghìn năm tuổi và những kỹ thuật này đã được sử dụng để xác định mọi thứ từ voi ma mút 800.000 năm tuổi đến xác ướp từ khắp nơi trên thế giới.
Thành phần phản ứng PCR
- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại.
- Cặp mồi (primer) là các đoạn DNA ngắn (dưới 50bp) để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.
- Taq DNA-polymerase là enzyme xúc tác cho việc nhân lên của DNA.
- Nucleotides (dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase tổng hợp DNA mới.
- Dung dịch đệm, Mg2+cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase.
Cách thức hoạt động của phản ứng chuỗi polymerase
Các bản sao gen được tạo bằng cách sử dụng một mẫu DNA và công nghệ này đủ tốt để tạo nhiều bản sao từ một bản sao duy nhất của gen được tìm thấy trong mẫu. PCR khuếch đại gen để tạo ra hàng triệu bản sao, cho phép phát hiện và xác định trình tự gen bằng kỹ thuật trực quan dựa trên kích thước và điện tích (+ hoặc -) của đoạn DNA.
Trong các điều kiện được kiểm soát, các đoạn DNA nhỏ được tạo ra bởi các enzyme có tên là DNA polymerase, enzyme này bổ sung các deoxynucleotide bổ sung (dNTP) vào một đoạn DNA được gọi là “mẫu”. Ngay cả những đoạn DNA nhỏ hơn, được gọi là “mồi” hay primer cũng được sử dụng làm điểm khởi đầu cho polymerase.
Mồi (primer) là những đoạn DNA nhỏ nhân tạo (oligomer), thường dài từ 15 đến 30 nucleotide. Chúng được tạo ra bằng cách biết hoặc đoán các chuỗi DNA ngắn ở phần cuối của gen được khuếch đại. Trong quá trình PCR, DNA được giải trình tự được làm nóng và các chuỗi kép tách ra. Sau khi làm mát, các đoạn mồi liên kết với khuôn mẫu (được gọi là ủ) và tạo ra một vị trí để polymerase bắt đầu hoạt động.
Kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) có thể thực hiện được nhờ khám phá ra các enzyme ưa nhiệt và polymerase ưa nhiệt (các enzyme duy trì tính toàn vẹn cấu trúc và chức năng sau khi nung ở nhiệt độ cao). Các bước liên quan đến kỹ thuật PCR như sau:
- Denaturing: Một hỗn hợp được tạo ra với nồng độ tối ưu của khuôn mẫu DNA, enzyme polymerase, mồi và dNTP. Khả năng làm nóng hỗn hợp (denaturing) mà không làm biến tính enzyme cho phép biến tính chuỗi xoắn kép của mẫu DNA ở nhiệt độ trong khoảng 94 độ C.
- Annealing: Sau khi biến tính, mẫu được làm lạnh đến nhiệt độ vừa phải hơn, khoảng 54 độ C, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ủ (liên kết) của đoạn mồi với mẫu DNA sợi đơn.
- Extension/Elongation: Trong bước thứ ba của chu trình, mẫu được hâm nóng đến 72 độ C, nhiệt độ lý tưởng cho Taq DNA Polymerase, để kéo dài. Trong quá trình kéo dài, DNA polymerase sử dụng chuỗi DNA đơn ban đầu làm khuôn mẫu để thêm các dNTP bổ sung vào đầu 3′ của mỗi đoạn mồi và tạo ra một đoạn DNA chuỗi kép trong vùng của gen quan tâm.
- Các đoạn mồi đã được ủ với các trình tự DNA không khớp chính xác sẽ không được ủ ở 72 độ, do đó hạn chế sự kéo dài của gen quan tâm.
Quá trình biến tính, ủ và kéo dài này được lặp lại nhiều lần (30-40), do đó làm tăng số bản sao của gen mong muốn trong hỗn hợp theo cấp số nhân. Mặc dù quy trình này sẽ khá tẻ nhạt nếu được thực hiện thủ công, các mẫu có thể được chuẩn bị và ủ trong Máy điều nhiệt (Thermocycler) có thể lập trình, hiện phổ biến ở hầu hết các phòng thí nghiệm phân tử và phản ứng PCR hoàn chỉnh có thể được thực hiện trong 3-4 giờ.
Mỗi bước biến tính sẽ dừng quá trình kéo dài của chu kỳ trước, do đó cắt ngắn chuỗi DNA mới và giữ nó ở kích thước xấp xỉ của gen mong muốn. Thời gian của chu kỳ kéo dài có thể dài hơn hoặc ngắn hơn tùy thuộc vào kích thước của gen quan tâm, nhưng cuối cùng, qua các chu kỳ PCR lặp đi lặp lại, phần lớn các mẫu sẽ bị giới hạn ở kích thước của gen quan tâm, vì chúng sẽ được tạo ra từ sản phẩm của cả hai đoạn mồi.
Có một số yếu tố khác nhau để PCR thành công có thể được điều chỉnh để nâng cao kết quả. Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để kiểm tra sự hiện diện của sản phẩm PCR là điện di trên gel agarose. Được sử dụng để phân tách các đoạn DNA dựa trên kích thước và điện tích. Các mảnh vỡ sau đó được hiển thị bằng cách sử dụng thuốc nhuộm hoặc đồng vị phóng xạ.
Cuộc cách mạng
Kể từ khi phát hiện ra PCR, DNA polymerase khác với Taq ban đầu đã được phát hiện. Một số trong số này có khả năng “hiệu đính” tốt hơn hoặc ổn định hơn ở nhiệt độ cao hơn, do đó cải thiện tính đặc hiệu của PCR và giảm sai sót do chèn dNTP không chính xác.
Một số biến thể của PCR đã được thiết kế cho các ứng dụng cụ thể và hiện được sử dụng thường xuyên trong các phòng thí nghiệm di truyền phân tử. Một số trong số này là Real-Time PCR và PCR phiên mã ngược (Reverse-Transcriptase). Việc phát hiện ra PCR cũng dẫn đến sự phát triển của giải trình tự DNA, dấu vân tay DNA và các kỹ thuật phân tử khác.
Bài viết đến đây là hết rồi. Hi vọng sẽ giúp ích cho các bạn phần nào trong tương lai. Lần sau nếu có ai hỏi về chủ đề này thì hãy nhớ về hóa học đằng sau chúng nhé!
Tham khảo Thoughtco.
